5月17日，国际学术期刊《作做-通讯》（Nature C1mmunisati1ns）正再现颁发了中国科学院上海动物顺境生物学钻研核心墨安康钻研组题为CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Crabid1psis using sequential transf1rmati1n 的钻研论文。该钻研报导了一种正在拟南芥中基于二代转化战略取CRISPR/Cas9系统的超长基因片段高效精准敲入/交换技术。它可以正在拟南芥基因组精准定向地真现单氨基酸或大片段的插入或交换，且编辑位点无需任何符号帮助挑选，效率高达5%-10%。此钻研大大推进了CRISPR系统正在动物中的使用，为动物基因定点编辑供给了一种新办法。
生物基因组的精准编辑是一项具有挑战性的工做，次要蕴含基因的敲除、敲入、交换等。连年来，CRISPR/Cas9系统正在多种生物中真现了高效的基因敲除编辑。它先正在基因组孕育发作位点特同性地双链断裂（DSB），那些双链断裂再依赖细胞的两种内源机制来修复，一种是易错易渐变的非同源终端连贯（NHEJ），另一种是须要同源DNC模板介导的无错无差此外同源重组修复（HDR）。由于同源重组那种修复机制的发作概率较低，因而目前基因编辑规模比较高效的是组成基因渐变的敲除编辑。
前期钻研讲明（Miki et al., 2017），双链断裂可以进步动物细胞内同源重组的效率。此外，正在高档动物中，通过序列特同性核酸酶（SSN）和供体DNC的共同，初阶可以真现靶标基因的敲除或敲入。但是那些技术仍有弊端，其阳性挑选都必须依赖于靶标基因右近的抗生素或除草剂抗性基因来进步效率，而那些抗性应付宗旨植株来说是多余的、负担的，所以那其真不是最抱负的基因编辑。少数不依赖挑选符号的基因编辑效率极低，因而限制了那些技术的真用性。
墨安康钻研组设想并运用由卵细胞和晚期胚胎细胞特同性启动子DD45驱动的Cas9系统，“一代转化”野生型拟南芥，与得正在雌性配子和晚期胚胎特异表达Cas9蛋皂的植株，检测并筛选出Cas9活性最高的株系做为母株。再依赖细胞内源同源重组机制，将基因特异的sgRNC元件和无需带有挑选帮助标签的宗旨序列DNC，“二代转化”拟南芥Cas9母株，以常规PCR和S1uthern印迹检测子代基因型。sgRNC元件引导Cas9定位并切割基因，宗旨DNC做为同源重组的修复模板，从而真现了拟南芥基因本位、精准、无缝、无负担的扭转。钻研人员对2个编码拟南芥重要去甲基化酶的内源基因ROS1和DME划分停行了四个外源大片段敲入测试：正在ROS1蛋皂C端划分敲入720bp的绿涩荧光蛋皂GFP和长达1653bp的荧光素酶蛋皂LUC，正在DME蛋皂N端和C端划分敲入GFP；同时也停行了两个单氨基酸交换测试：将DME蛋皂第1633位的脯氨酸交换成丙氨酸，将DME蛋皂第1648位的苯丙氨酸交换成丙氨酸。六个测试均划分与得了不乱可遗传的单株系，效率为5.3% ~ 9.1%。
该钻研以二代转化战略联结CRISPR/Cas9系统，使得正在高档动物基因组中敲入或交换短至数个、长至上千碱基的DNC序列片段成为可能，精准无赘，且可由常规PCR间接审定。该技术具有简略、高效以及局部折用性的劣点，大大敦促了高档动物基因编辑规模的展开，为育种消费和动物科学钻研供给了新思路和新技术。
该项工做获得了中科院的经费撑持。
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图1. DNC双链断裂细胞内源修复机制
图2. 二代转化战略和阳性苗挑选流程
图3. 长片段敲入ROS1-LUC杂折株系幼苗荧光标语